ESPECTROFOTÓMETRO

¿Qué es un espectro fotómetro?

Es un instrumento usado en la física óptica que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica o espectrofotómetro de masa.

 Componentes de un espectrofotómetro:
1.Fuente de luz: Ilumina la muestra. Debe cumplir con las condiciones de estabilidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son lámpara de tungsteno y lámpara de arco de xenón.

2. Monocromador: Para obtener luz monocromática, constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión. El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto.

3. Fotodetectores: En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 foto-detectores para percibir la señal en forma simultánea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes móviles del equipo. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra.

 

Esto le permite al operador realizar dos funciones:

1. Da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra.

2. Indica indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. También mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz ultravioleta. La longitud de onda. La longitud de onda es determinada por un prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo  a la longitud de onda escogida. Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del haz. Este haz atraviesa la muestra y llega a un tubo fotográfico, donde es medido. La cantidad de luz que atraviesa la muestra es el porcentaje de tramitación. Una característica del instrumento es la necesidad de “blanquear” el aparato antes de cada lectura. Esto se hace colocando una cubeta con una solución control que tenga todos los componentes de la reacción menos la sustancia que va a ser medida en el instrumento. El propósito de esto es eliminar el registro de absorbancia que puedan presentar los demás componentes de la reacción a esa longitud de onda particular. Todas las moléculas presentan absorbancia porque todas interfieren con el paso de la luz. Sólo que la absorbancia será óptima a una longitud de onda de luz específico para cada tipo de sustancia.

Uso correcto:
El espectro fotómetro está diseñado para ser utilizado en cualquier superficie plana y rígida. Se requiere una toma de corriente en un radio de aproximadamente dos metros. El lugar de trabajo deberá estar limpio, protegido de la luz solar directa y de corrientes de aire, a temperatura aproximadamente constante y libre de interferencias eléctricas. La temperatura ambiente deberá estar comprendida en el rango 1º a 35 grados.

MÉTODOS FOTOMÉTRICOS DE ANÁLISIS

1. NATURALEZA DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

La Radiación Electromagnética es una forma de Energía radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenómeno ondulatorio se define:

a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, según el S.I. en nanómetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1mm =10 A⁰ = 10^{-9 m.}

b) Frecuencia (n): es el número de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su fórmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o hertzios.

c) Fotones: la luz está formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de un fotón depende de la frecuencia y de la longitud de onda, según la siguiente expresión: E = h x n = h x c/n (h = Cte. de Planck = 6,62.10^-27erg/seg.). La Energía Electromagnética se mide el Ergios. La relación entre la longitud de onda y la Energía es inversa, por lo tanto a menor longitud de onda mayor Energía y viceversa.

d) Espectro Electromagnético: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos g de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las más interesantes para nosotros son:

· Región Ultravioleta: l = 10-380 nm

· Región Visible: l = 380-780 nm

· Región Infrarroja: l = 780-30.000 nm

En la Región Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con una molécula puede ser dispersada o absorbida.

2. FENÓMENOS DE INTERACCIÓN ENTRE LUZ Y MATERIA

A. FENÓMENO DE ABSORCIÓN

Cuando una partícula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partícula en estado excitado. La molécula absorbe la E de la onda y aumenta su energía, y ese aumento de energía es igual a la E de la Radiación Electromagnética absorbida (E = h.n). La partícula en estado excitado tiende a volver de forma espontánea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor.

“Espectro de Absorción”. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromógeno, tiene un determinado espectro de absorción. El espectro de absorción es un gráfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución es el fundamento de la espectrofotometría de absorción.

Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).

B. FENÓMENO DE EMISIÓN

Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisión de energía radiante. En este caso, lo que se mide es la energía emitida y, en este fenómeno se basa la “fotometría de llama” o la “fluorescencia”.

3. LEYES DE ABSORCIÓN

Cuando un haz de luz pasa a través de un medio, se registra una cierta pérdida de intensidad, debido a la absorción por parte de la sustancia.

Se llama “TRANSMITANCIA (T)” a la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:

T = I_s / I₀ ; %T = (I_s / I₀ ) x 100.

Se puede perder intensidad por la interacción con la cubeta o el solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una solución de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir. Todas las medidas que se hagan con posterioridad serán referidas a esta medida inicial y se harán en la misma cubeta que se utilizó en la medida del blanco.

La Transmitancia se usa poco, se emplea más la Absorbancia (A) porque la relación entre A y la concentración de una solución es directamente proporcional y la de la T es inversamente proporcional.

La relación entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente:

- Si el %T = 100 A = 2-log T = 2-log 100 = 0

- Si el %T = 0 A = 2-log 0 = ¥

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a absorbancia.

3.1. LEY DE BEER

“La absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración y a la longitud del paso de la luz”.

A = e . b. c

Siendo:

A: absorbancia. No tiene unidades.

e: el coeficiente de extinción molar, también llamado coeficiente de absorción. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm).

b: es la longitud de paso de la luz, en cm.

c: es la concentración del absorbente. Se mide en mol/L.

La aplicación práctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una sustancia podemos averiguar su concentración y esto lo podemos hacer de dos formas:

1. Por comparación con una solución conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y una estándar (S), podemos establecer la siguiente relación matemática entre ellas:

2. A través de una curva de calibración: la curva de calibración es la representación gráfica en un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentración (eje de abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentración conocida y se determinan sus A, construyéndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su concentración se averigua por interpolación de las A de las soluciones problema en la curva de calibración.

Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre Absorbancia y Concentración.

Cuando la concentración del cromógeno sobrepasa los límites de linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtiéndose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los límites de linealidad se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno. En esta situación, hay que diluir la muestra para que su concentración entre en los límites de la linealidad.

· Empleo de los Factores de Calibración: Para reactivos estables y sistemas fotométricos estables, este factor se puede mantener constante, siendo sólo necesario ensayar las muestras problema multiplicando la A resultante por el factor F.

4. ESPECTROFOTÓMETRO

Se distinguen dos tipos de aparatos:

· Fotómetro o Colorímetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso de una determinada longitud de onda.

· Espectrofotómetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz monocromático cuya longitud de onda se varía a voluntad. Los monocromadores pueden ser de dos tipos: prismas y redes de difracción.

Pag.Recomendada

http://www.gusgsm.com/funciona_espectrofotometro_reflectancia

http://www.doschivos.com/trabajos/quimica/549.htm
http://www.uv.es/=bertomeu/material/museo/instru/espectro.htm

CALIBRACIÓN DEL ESPECTOFOTÓMETRO

En la calibración del espectrofotómetro, una solución de referencia se utiliza a cero el equipo. Esta solución proporciona una base o punto cero. El aparato se calibra mediante la colocación de la solución de referencia dentro del espectrofotómetro, la reducción a cero a cabo los ajustes, y ejecutar el instrumento. Luego, las muestras de un material de prueba real puede ser sometido a la espectrofotometría en la confianza de que la máquina ha sido calibrada y funciona correctamente.

En un espectrofotómetro de haz simple, un rayo de luz se genera, y el dispositivo debe ser calibrado para cada uso. En un espectrofotómetro de doble haz, las vigas se pueden enviar a través de una muestra y una muestra de referencia, al mismo tiempo para generar dos conjuntos de resultados que pueden ser utilizados como referencia y calibración. En cualquier caso, la calibración del espectrofotómetro se puede hacer en el laboratorio por alguien que trabaja con la máquina. Si la máquina se desarrolla problemas graves, puede ser enviado al fabricante para el mantenimiento, reparación y reemplazo potencial. Para que un espectrofotómetro para funcionar correctamente, se le debe permitir hacer calentamiento antes de usar. Muchos dispositivos alrededor de 10 minutos para calentar. Es importante evitar la realización de la calibración del espectrofotómetro durante la fase de calentamiento, ya que esto tire la configuración de apagado. También es importante ser conscientes de que para ciertos tipos de longitudes de onda, filtros especiales y accesorios pueden ser necesarios para que el dispositivo funcione.

Mantenimiento:
http://www.fao.org/docrep/T0845S/t0845s0t.htm